一 样品准备
1 细胞样品：将需要抽提的蛋白的细胞从培养箱中取出，吸去培液，适量预冷的1×PBS洗涤2次，吸去PBS，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液，4℃充分裂解细胞，将细胞刮入1.5ml EP管中，95℃以上加热10分钟，12000g离心 10 分钟，取上清，进行蛋白质定量后贮存于 -80℃冰箱。
2 组织样品：
新鲜组织：将组织剪成细小的碎片，按每20mg组织加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃ 12000g 离心15分钟，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。
冷冻组织：于-80℃冰箱中取出适量的组织在液氮中迅速研磨成粉末，将研磨好的粉末转移到含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液的离心管中，4℃ 12000g 离心15分钟，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。
蛋白定量
1 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂
| 孔号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
| 蛋白标准液（μl） |
0 |
2 |
4 |
6 |
8 |
12 |
16 |
20 |
| 去离子水（μl） |
20 |
18 |
16 |
14 |
12 |
8 |
4 |
0 |
| 对应蛋白浓度（μg/μl） |
0 |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
2. 根据样品数量，将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液，充分混匀；
3. 各孔加入180μl BCA工作液；
4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度。以吸光值为横坐标，蛋白浓度（μg/μl）为纵坐标，绘出标准曲线；
5. 在酶标板中加入2μl待测蛋白和18μl PBS（稀释10倍），加入180μl BCA工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度，每个样本重复做两个孔。
6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度（μg/μl），乘以样品稀释倍数（10）即为样品实际浓度（单位：μg /μl）。
三 PAGE胶的制备
1. 下层分离胶的制备
根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度，高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。不同浓度的分离胶按下表进行配制，待下层胶凝固后进行上次浓缩胶的配制。
2. 上层浓缩胶的配制
根据需要按下表配制浓缩胶，并插好梳子。
四 上样及电泳
1. 上样
每孔上样量为20-40μg蛋白，可以根据实验要求加大上样量。根据蛋白定量结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液，沸水浴10min后离心取上清上样。将配制好的PAGE胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，取下梳子用枪轻轻吹打加样孔，避免孔内有余胶残留影响上样。将准备好的样品用加样枪慢慢加到对应的孔内，注意勿溢出加样孔。
2. 电泳
一般浓缩胶80V 20分钟，分离胶120V 60分钟，可以根据具体实验要求调整电压和时间。当染料到达胶底部时切断电源，停止电泳，进行下一步转膜。
五 转膜
转膜分为湿转和半干转，一般分子量小于100KD选择半干转。湿转膜三明治排列为：海绵
/虑纸
/胶
/膜
/虑纸
/海绵，全部紧密排列，特别是胶
/膜之间不能留有气泡，三明治安放的方向为负极为胶，正极为膜，带负电的蛋白由负极向正极方（膜）迁移。30V转膜30分钟，可以根据胶的厚度以及蛋白的大小增加转膜时间。标准的电转缓冲液为1X Tris-glycine buffer 不含SDS，但加入20%甲醇，如果转膜的蛋白分子量大于80KD，则推荐加入SDS 使之终浓度为0.1%。
半干式转膜中，三明治的排列为：
/虑纸
/胶
/膜
/虑纸，用电转缓冲液浸湿后，直接置于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。半干式的电转缓冲液不同于湿式的电转缓冲液，推荐为：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。25V转膜30分钟即可。转膜前将PVDF膜在甲醇中浸泡1-2 分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中5 分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5 分钟，否则转膜时会导致条带变形。
六 膜上蛋白的检测
为检测转膜是否成功，可用丽春红染色，丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液1：10 稀释，即加9 倍的ddH
2O
染色方法：将膜放入TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色5 分钟，大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰，（膜也可以用TBST 或水重新洗后再进行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。
七 膜的封闭及抗体孵育
1. 封闭：5%脱脂奶粉（检测磷酸化蛋白用BSA）室温封闭1小时或4℃过夜。
2. 一抗：不同公司生产的一抗浓度不同，根据说明书稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育2小时或4 ℃孵育过夜。
3. 二抗：孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次5min。随后根据用量，ECL法按10ml抗体稀释液加入5μlHRP标记二抗（1:2000），与膜374℃孵育1h。用TBST洗涤3次，每次5min。
八 显色
ECL化学发光检测：配制ECL发光液，根据用量，取ECL发光液A和B等量混匀，加在膜的正面暗室避光5分钟。倒掉显色液，用纸小心吸取显色液，在上面盖上一层平整的透明纸。暗室中打开红外灯，取出感光胶片做好标记，轻轻放在膜上，显色30-60s，拿开胶片立即完全浸入显影液中1-2min，在放入定影液中1min，离开暗室观察结果。可以根据条带强弱再次感光或减短感光时间已达到理想结果。
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