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线粒体复合体Ⅰ试剂盒说明书

线粒体复合体Ⅰ试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
复合体Ⅰ(EC 1.6.5. 3)又称NADH-CoQ 还原酶或NADH脱氢酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH 传递给CoQ,同时可使O2还原生成O2.-,是呼吸电子传递链上产生O2.-的主要部位。测定该酶活性,不仅可以反映呼吸电子传递链(ETC)状态,而且可以反映活性氧(ROS)生成状态。
测定原理
复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成 NAD+,在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:液体 20mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:液体 1.5mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂四:液体 25mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂五:液体 1mL×1 支,-20℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存,用时加入2mL蒸馏水,现配现用。
工作液的配制:临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解;现配现用;
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g,4℃离心 5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ(此步可选做)。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅰ酶活性测定。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)工作液于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、200μL工作液和15μL试剂六,混匀,记录340nm处初始吸光值A1和2min 后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
复合体Ⅰ活力单位的计算
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
(1)按蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T
=1808×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)
÷T=365×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.73×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2.25×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下:
(1)按蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T
=3616×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)
÷T=730×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.46×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2.25×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;
T:反应时间,2 min;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
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