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线粒体复合体Ⅳ试剂盒说明书

线粒体复合体Ⅳ试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶,也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责催化还原型细胞色素C的氧化,并最终把电子传递给氧,生成水。
测定原理:
还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收,线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C,因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:液体 20mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:液体 1.5mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂四:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1 支,-20℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆 600g,4℃离心 5min。
3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心 10min。
4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ(此步可选做)。
5、步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅳ酶活性测定。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至550nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)工作液的配制:临用前将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解,置于37℃(哺
乳动物)或 25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂 4℃可保存一周;
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和200μL工作液,混匀,立即记录550nm
处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。
注意点: 若 ΔA 大于0.2,需将样本用试剂二稀释适当倍数(计算公式中乘以相应稀释倍数),
使 A1-A2 小于 0.2,可提高检测灵敏度。
复合体Ⅳ活力单位的计算:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=1099×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力 (nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d )×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=222×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.444×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2.1×10 -4 L;ε:细胞色素 C 摩尔消光系数,1.91×104 L/ mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=2198×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力 (nmol/min/g 鲜重 )=[ΔA×V反总÷(ε×d )×109]÷(W×V样 ÷V样总)÷T=444×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.888×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2.1×10 -4 L;ε:细胞色素 C 摩尔消光系数,1.91×104 L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
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