线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书

微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
线粒体复合体Ⅴ又称F₁F₀-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
测定原理：
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：80mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：2mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入2mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存;
试剂五：8mL×1 瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入4mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；
试剂九：液体 10mL×1 瓶，室温保存。
定磷试剂的配制：按H₂O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选
做）。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入800uL试剂二和8uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。
测定步骤：
1、 酶促反应（在EP管中加入下列试剂）

试剂名称（μL）	对照管	测定管
试剂四	20	20
试剂五	80	80
样本		100
混匀， 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确水浴 30min
试剂六	40	40
样本	100

混匀，4000g，25℃离心 10min，取上清液
2、 定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂）

上清液	30	30
定磷试剂	170	170

混匀，室温静置10min后，在660nm处读取A测定管和A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。
复合体Ⅴ活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y= 1.2487x + 0.0361；x为标准品浓度（mmol/L），y为A 值。
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反总×10⁶]÷(V样×Cpr) ÷T=64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反总×10⁶]÷(W×V 样÷V 样总)÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min/10⁴cell）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反总×10⁶]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.103× (ΔA-0.0361)
V 反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L； V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y=0.624x + 0.0361；x为标准品浓度（mmol/L），y 为A 值。
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反总×10⁶]÷(V 样×Cpr) ÷T=128× (ΔA-0.0361) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min/g 鲜重）=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反总×10⁶]÷(W×V 样÷V 样总) ÷T=103.4× (ΔA-0.0361) ÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（nmol/min /10⁴cell）=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反总×10⁶]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.206× (ΔA-0.0361)
V 反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。